Intérêts. Au début des années 1560, l'échec de Panfilo de Narváez et Hernando de Soto à découvrir des richesses facilement extractibles et l'hostilité de puissantes tribus indiennes telles que les Calusa se sont combinés pour diminuer l'intérêt des Espagnols dans le sud-est de l'Amérique du Nord. La Florida, cependant, a continué d'attirer l'attention de l'Espagne et d'autres États européens en raison de sa position stratégique juste au nord du parcours que la flotte de trésors espagnole annuelle a entrepris son voyage de retour riche en argent à Séville. Après la paix de Cateau-Cambrésis en 1559, la couronne française en particulier considérait la Floride comme un endroit idéal à partir duquel les corsaires pourraient attaquer la flotte au trésor et piller les colonies espagnoles du Nouveau Monde. La France a donc projeté d'établir un fort sur la côte atlantique de la péninsule. Pour la couronne espagnole, en revanche, la Floride a servi de rempart critique qui protégeait ses possessions des Caraïbes contre les pillards. Une grande partie des efforts de l'Espagne pour défendre son empire du Nouveau Monde visait par conséquent à garantir qu'un rival européen comme la France ne prenne jamais possession de la péninsule.
Fort Caroline. Après l'échec de l'expédition Tristán de Luna y Arellano en 1562, le roi Philippe II d'Espagne a conclu que les Indiens Timucua et Calusa étaient eux-mêmes suffisamment puissants et hostiles pour éloigner les concurrents européens de l'Espagne de la Floride. Cette même année, cependant, l'amiral français Gaspard de Coligny, huguenot ou protestant français, envoya une expédition pour établir une colonie éphémère sur le site de l'actuel Port Royal, en Caroline du Sud. Bien que cette colonie ait échoué, Coligny a décidé d'envoyer une deuxième force de deux cents soldats et colons sous le commandement de René Goulaine de Laudonnière en Floride avec l'ordre d'établir une base permanente. Arrivé en juin 1564, le groupe de Laudonnière construisit le fort Caroline près de l'embouchure du fleuve Saint-Jean sur la côte atlantique de la Floride. Le conflit est venu rapidement pour eux; peu de temps après avoir construit leur colonie, ils se sont retrouvés impliqués dans les guerres intertribales des Indiens Timucua locaux. Plus important encore, les hommes de de Laudonnière attaquèrent bientôt les colonies et les navires espagnols dans les Caraïbes.
Réponse espagnole. La nouvelle de la colonie française persuada bientôt Philip de renverser son récent décret contre la colonisation de la Floride. Il ordonna par conséquent à Pedro Menéndez de Aviles, ancien commandant des flottes indiennes, de mener une expédition en Floride, de mettre fin à la menace française et d'établir une colonie espagnole permanente qui pourrait contrôler la péninsule. La puissante force de Menéndez de huit cents hommes est arrivée en Floride en août 1565 pour découvrir qu'une escadre française transportant cinq cents renforts les avait battus au fort Caroline. Conscient que l'infanterie huguenote nouvellement arrivée rendait impossible un assaut amphibie sur le fort, Menéndez décida de naviguer à quarante milles au sud et d'établir une base avant d'entreprendre une attaque terrestre sur la forteresse française. Peu de temps après l'arrivée à terre des Espagnols et l'installation de leur camp, les Indiens Timucua hostiles aux Français ont informé Menéndez que le commandant de la marine française, Jean Ribault, dépouillait le fort Caroline de la plupart de ses défenseurs afin de lancer un assaut amphibie surprise sur les Espagnols. Profitant de cette information et d'une violente tempête qui dispersa et détruisit la flotte de Ribault, Menéndez fit marcher ses troupes par voie terrestre et prit d'assaut le fort Caroline lors d'une attaque à l'aube réussie. Fidèle à la nature sauvage et impitoyable de la guerre de la Réforme, il accusa par la suite plus d'une centaine d'huguenots récemment rendus d'hérésie et les fit exécuter sur place. La plupart des survivants de la flotte de Ribault - y compris son commandant - reçurent un sort similaire. Avec l'aide de la nature et des Indiens Timucua, l'Espagne avait donc mis fin à la menace française contre la Floride.
Conséquences. La lutte entre la France et l'Espagne pour le contrôle de la Floride a eu des conséquences importantes à la fois pour la colonisation du sud-est et pour la guerre européenne dans le Nouveau Monde. La victoire espagnole a mis fin à une menace sérieuse pour les futures flottes de trésors et a considérablement limité la capacité de la France à se mêler des territoires des Caraïbes espagnols. La capacité de l'Espagne et de la France à rester en paix en Europe pendant que leurs forces combattaient dans le Nouveau Monde, quant à elle, renforçait les dispositions implicites du Traité de Cateau-Cambrésis selon lesquelles la guerre «au-delà de la ligne» n'affectait pas les relations dans l'Ancien Monde et cela «pourrait faire le bien» dans les Amériques. Plus important encore, le conflit a conduit l'Espagne à conclure qu'elle ne pouvait se prémunir contre une autre puissance européenne d'établir une base en Floride qu'en maintenant une implantation permanente sur la péninsule. Saint-Augustin, la base que Menéndez avait établie pour son attaque terrestre contre le fort Caroline, devint ainsi la première colonie européenne permanente en Amérique du Nord.